Residensslot for kongemagten
Under Kong Hans (1481-1513) og Dronning Christine blev Nyborg igen central for kongemagten, og i 1525 – under Frederik 1. (1523-33) – blev byen udpeget som fast kongelig residensby.
Christian 3. (1534-59) omskabte og udvidede Nyborg Slot og by. Det skulle være et værdigt knudepunkt for en ny og styrket kongemagt efter eformation i 1536. Nyborg Slot blev udbygget med en ny og prægtig riddersal, og en stor turneringsplads (det nuværende torv) blev anlagt foran slottet som en del af et imponerende fyrstespejl, der skulle iscenesætte den kongelige magt. Christian 3. byggede også Kongens Skibsbro og en processionsplads, så kongen med følge kunne ankomme standsmæssigt.
Tøjhus for garnisonen
I 1560’erne flyttede kongemagten til Nordsjælland. Svenskekrigene i 1650’erne gik hårdt ud over Nyborg Slot, og slottet blev opgivet som kongebolig. I stedet fungerede slottet som materiellager og våbenkammer for militæret i byen frem til 1913, et såkaldt tøjhus.
I militærets tid blev dele af slottets bygningskompleks revet ned.
Kulturarvsmonument
I 1915 påbegyndte Nationalmuseet en omfattende restaurering og genrejsning af Nyborg Slot, og i 1918 blev både slottet, voldanlægget og en række andre historiske bygninger i byen fredet. Arbejdet ophørte dog i 1923 på grund af manglende finansiering. Efterfølgende fik offentligheden adgang til slottet som museum.